在檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)中都采用微生物發(fā)酵法，而有價(jià)值的只有幾種曲霉菌和酵母菌，其中黑曲霉菌是工業(yè)中具有競(jìng)爭(zhēng)力的菌種，酵母中競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)的有解脂假絲酵母和季也蒙赤酵母等。 [7] 

黑曲霉是在瓊脂上培養(yǎng)的，在瓊脂上成局限菌落，在室溫下培養(yǎng)10~14天，成為豐富密集的孢子梗，菌落為黑色，有時(shí)也為深褐黑色。考慮到檸檬酸生產(chǎn)菌應(yīng)具有產(chǎn)酸能力強(qiáng)和耐檸檬酸濃度高的特點(diǎn)，可采用酸性濾紙法、變色圈法和單孢子移植法將黑曲霉分離出來(lái)，以避免其他雜菌干擾，使其成為生產(chǎn)檸檬酸用黑曲霉。 [7] 

酵母的培養(yǎng)可用于檸檬酸生產(chǎn)的酵母有解脂假絲酵母和季也蒙假絲酵母2種。前者有很強(qiáng)的分解脂肪的能力，較好的炭源是正烷烴。后者可由烷烴發(fā)酵生成檸檬酸，也可由糖類發(fā)酵生成檸檬酸，酵母發(fā)酵pH值為3.5~4.0。 [7] 

1940年，H.A.克雷伯斯提出三羧循環(huán)學(xué)說(shuō)以來(lái)，檸檬酸的發(fā)酵機(jī)理逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。已經(jīng)證明，糖質(zhì)原料生成檸檬酸的生化過(guò)程中，由糖變成丙酮酸的過(guò)程與酒精發(fā)酵相同，亦即通過(guò)E-M途徑（二磷酸己糖途徑）進(jìn)行酵解。然后丙酮酸進(jìn)一步氧化脫羧生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A和丙酮酸羧化所生成的草酰乙酸縮合成為檸檬酸并進(jìn)入三羧循環(huán)途徑。 [8] 

檸檬酸是代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)微生物體內(nèi)的烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低、而檸檬酸合成酶活性很高時(shí)，才有利于檸檬酸的大量積累。 [8] 

發(fā)酵工藝分表面發(fā)酵和固體發(fā)酵，按不同工藝制備不同原料的培養(yǎng)基，然后進(jìn)行蒸料。蒸料的目的是將淀粉糊化，并進(jìn)行滅菌。蒸料時(shí)要使物料受熱均勻，蒸汽通暢，邊蒸邊加料，把料加在冒汽的地方，逐層加入。蒸好的物料要揚(yáng)散攤涼，當(dāng)溫度降至37℃以下，即可補(bǔ)水接種，裝盤發(fā)酵，發(fā)酵終點(diǎn)以酸度來(lái)決定，定期測(cè)定酸度，保證在酸度最高時(shí)出料，以免檸檬酸被細(xì)菌分解。 [7] 

發(fā)酵結(jié)束后，要對(duì)發(fā)酵醛進(jìn)行處理。表面發(fā)酵要即時(shí)把菌蓋和發(fā)酵液分開(kāi)，再用少量水洗滌菌蓋和淺盤，發(fā)酵液和洗水合并；固體發(fā)酵中的檸檬酸要用水浸出，水溫80℃，浸出2~3次，浸水合并。發(fā)酵酸用壓濾機(jī)過(guò)濾，濾液和洗水合并，打入濾液槽。檸檬酸與鈣鹽和鈣堿反應(yīng)生成檸檬酸鈣從液相中沉淀出來(lái)，與可溶性雜質(zhì)分開(kāi)。酸液中若含草酸多，則可在熱的中和液中，于pH值3以下沉淀析出，從而使草酸鹽先分離出來(lái)。中和終點(diǎn)用精密試紙測(cè)試，保持pH值在6.0~6.8。在85℃左右攪拌30分鐘，使硫酸鈣充分析出，過(guò)濾。檸檬酸鈣用硫酸酸解，按溶液中檸檬酸含量確定硫酸的用量，一般硫酸過(guò)量不超過(guò)0.2%。酸解后，酸液進(jìn)行過(guò)濾。檸檬酸溶液的凈化通過(guò)吸附脫色和離子交換除去溶液中的色素、膠體和鐵離子、鈣離子、銅離子、鎂離子等金屬陽(yáng)離子以及硫酸根離子等陰離子雜質(zhì)。 [7] 

凈化多在色譜柱上進(jìn)行，脫色炭是GH-15顆粒炭，離子樹(shù)脂是陰、陽(yáng)樹(shù)脂。檸檬酸凈化液的濃度僅20%~25%，只有濃縮到70%以上才能進(jìn)行結(jié)晶。濃縮時(shí)溫度不能過(guò)高，以免檸檬酸分解，凈化液的濃縮可在負(fù)壓下進(jìn)行，為了節(jié)能，可采用雙效或三效蒸發(fā)器。濃縮分2段進(jìn)行，第1次濃縮后，放入沉降槽中保溫沉降，再除去大部分石膏；第2次濃縮液含檸檬酸約80%，及時(shí)放料結(jié)晶。第2次濃縮可用升降式或括板式蒸發(fā)器，以減少料液和熱媒的接觸時(shí)間，可提高產(chǎn)品質(zhì)量。結(jié)晶方式不同可得不同產(chǎn)品，一水檸檬酸的結(jié)晶是將80%溶液，溫度在55℃時(shí)，在結(jié)晶器中攪拌下自然冷卻，當(dāng)溫度降至40℃時(shí)，加入晶種，開(kāi)始結(jié)晶，控制溫度不超過(guò)36℃，此時(shí)產(chǎn)品為一水檸檬酸；如果溶液在60℃條件下濃縮到83%，冷卻至46℃加入晶種，維持溫度在40~60℃慢慢結(jié)晶，最終降到38℃，產(chǎn)品為無(wú)水檸檬酸。晶膏分密離心得結(jié)晶狀的商品檸檬酸。 [7]